生物信息学软件-1

生物信息学资料1，常用软件，酶切位点分析

2010-04-02 8:27

一、生物信息学软件简介

（一）分类

•单机分析软件，如：winplas

•在线分析软件， 如：webcutter

•生物学数据库，如：NCBI, DDBJ, EBI

（二）意义

1.分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间。

2.提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验。

3.用计算机管理实验数据。

（三）常用功能（核酸类）

DNA 序列片断拼接----Contig Express

DNA序列测定图谱分析

分析mRNA开放读框

限制性酶切位点分析

DNA 模拟电泳

PCR 引物设计

RNA二级结构分析

常用功能（蛋白质类）

蛋白质一级结构分析（氨基酸分析）

蛋白质二级结构分析（结构域分析）

蛋白质三级结构分析（空间结构分析）

常用功能（共同类）

DNA、蛋白质序列同源分析

进化树构建

常用功能（其它类）

质粒绘图类

图象处理软件

二、DNA 序列片断拼接（电子基因克隆）

•获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。

•然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。

•再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。

Vector NTI 5.2 中的contig Express

Contig Express软件：

Sequencer软件：

ftp://genecodes.com/pub/SequencherPC.zip

举例说明使用

三、DNA序列测定图谱分析

Chromas软件： http://www.technelysium.com.au/chromas230.exe

四、限制性核酸内切酶位点的分析

（一）定义：

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）

识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。即一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。

是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。

其中的II类限制性核酸内切酶是重组DNA技术中的重要工具酶。

II类酶识别序列特点为回文结构，大多为 4~6 bp 回文结构（palindrome sequence），

如EcoRI 识别序列：

n5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’
3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’

限制性核酸内切酶命名

•Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水

例如： 流感噬血杆菌d株
（Haemophilus influengae d）
Hind Ⅰ
Hind Ⅱ

Hind Ⅲ

Hind Ⅳ

常用的限制性核酸内切酶酶切序列

限制酶 识别序列及切口 限制酶 识别序列及切口

Alu Ⅰ AG/CT Hind Ⅲ A/AGCTT
TC/GA TTCGA/A

BamHⅠ G/GATCC SalⅠ G/TCGAC
CCGAG/G CAGCT/G

BglⅠ A/GATCT SmaⅠ CCC/GGG
TCTAG/A GGG/CCC

EcoRⅠ G/AATTC
CTTAA/G

CTTAA/G

（二）分析步骤：

利用Vector NTI软件：

http://register.informaxinc.com/solutions/

vectornti/molecular_viewer.html

该软件输入文件格式广泛，除了molecule documents (.gb) 是该公司本身文件格式外，还能识别各种数据库应用格式软件：EMBL,GenBank,FASTA,Sequence files. 可以查找特定序列，ORF（可以设置相关参数），描述载体、限制酶位点、一些功能序列和附注。整个界面由文本、图形和序列三部分构成，而且点击任意的序列、RE、基因，图形和序列均会自动标记到相应位置，非常直观方便。 载体可以圆形表示也可以线形表示。 还可进行核酸到蛋白的翻译等功能。

利用webcutter 2.0在线免费软件分析：

http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html

或：

http://www.ccsi.com/firstmarket/cutter

DNAStar、DNAClub、DNATool 等其他商业软件均能分析。
以DNAClub为例说明。

五、PCR 引物设计（包括杂交探针设计）

（一）引物设计的原则

1.引物要跟模板紧密结合；

2.引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；

3.引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。

（二）引物设计需要考虑的因素

?引物长度（primer length），

?产物长度（product length），

?序列Tm值 (melting temperature)，

?ΔG值(internal stability)，

?引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），

?错误引发位点（false priming site），

?引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

（三）引物设计要点

?一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。

?引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。

?引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

?引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。

?ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。

?一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

?其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。

?可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。

?引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。

?对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。

（四）、引物设计软件的使用

?推荐使用自动搜索软件（商业软件）： Primer Premier 5.0

?推荐使用引物评价软件（商业软件） ： Oligo 6

其网址： http://www.oligo.net

 

?设计引物的免费在线软件Primer3，其网址：

http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi

或http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

我的评价：

是非常优秀的设计引物的软件！

是真正的“免费的午餐”！

Winplas （商业软件）

pDRAW32软件（商业软件），其网址：

http://hjem.get2net.dk/acaclone，可以看到演示版和有关信息

Vector NTI （商业软件）

Plasmid processor

其免费下载的网址

http://www.hytti.uku.fi/%7Eoikari/plasmid.html

?DMUP beta

其免费下载的网址

http://biosoft.im.ac.cn/down/dmup.zip

Plasmid processor质粒作图软件是压缩软件，需要先将其解压到一个目录下（不需安装即可直接应

用），然后才能应用。（压缩文件是网络传输的最常用文件，目的是为了传输

方便）；

1）在资源管理器中双击Plasmid.exe 文件（553kb)，进入作图的界面；

2）点file-->new,在出来的对话框中填上Plasmid name和length,比如分别填

pBR322和4322（bp)（注意不能填4.322kb，否则软件不认识）。点击OK，进入

下一个界面，上面是一个圆，标着pBR322和4322bp。

3）点-->date-->restriction site加酶切位点，填酶的名称及定位；

4）点Date-->multiple-->Genes,填基因名称（如E6），位点在500至890处，

还是在此对话框中，选择右下角的style选所加基因的格式是箭头还是长的圆

弧等格式（根据喜好），选厚薄度（thichness),然后点击此对话框右上部分

的Add Gene，，在点击done，于是基因就加上了。基因和酶切位点可反复加多次。

5）但本软件缺陷之处上多克隆位点不能直接加，只能通过点-->date-->
restriction site加酶切位点，在此对话框中加多克隆酶切位点（如加HinIII,
EcoRI,BstI时，点-->date-->restriction site加酶切位点，出现对话框后，
HinIII,location比如填1，-->Add site; EcorI填3,-->Add site; Bst填5-->
Add site;然后点击OK.在圆上将位点1~5处用鼠标往旁边分别一拖，就可看见这三个位点了。

七、进化树分析软件

MEGA3.0：免费分子进化遗传分析软件

http://www.megasoftware.net

Vector NTI：商业软件

Vector NTI Suit 同源比较—主窗口

随着人类基因组计划的开展，争夺有限基因资源的竞争日益激烈，利用网上软件分析未知序列，迅速得到尽可能多的信息显得尤为重要。仅仅在几年前，网上只零散地分布着一些功能简单的小程序用于新基因的鉴别，现在这些软件有了长足的发展。

目前，在国际上，一些优秀的软件根据功能归类被集中在一个网页上，极大地方便了使用。 http://bioinformatics.weizamann.ac.il/gdp/gdp.html

在国内，很多生物信息学软件来源信息（包括不少免费下载的软件）都可以生物软件网上获得。

http://www.bio-soft.net

http://biosoft.im.ac.cn